Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)
Этот метод более перспективный благодаря подаче пробы под высоким давлением. Сложные пробы одновременно разделяются и детектируются, параллельно определяется концентрация компонентов. Самое важное преимущество заключается в возможности исследования веществ, отличающихся химическими и физическими характеристиками. Это позволяет использовать ВЭЖХ как в различных отраслях промышленности, так в научных исследованиях.
Методы высокоэффективной ЖХ
Системы блочно-модульные, элюенты состоят из нескольких компонентов, сорбенты неподвижные жидкие или твердые модифицированные.
Основные типы ВЭЖХ:
-
нормально-фазовый (с неполярной подвижной фазой, полярной неподвижной для работы с изомерами, соединениями, чувствительными к воде, хиральными соединениями);
-
с обращенной фазой (с подвижной фазой из растворителя, разбавленного водой, длЯ разделения любых ионных соединений);
-
ионообменный (с подвижной фазой из буферного раствора для работы с заряженными частицами);
-
эксклюзионный (с неподвижной пористой фазой для разделения молекул белков или полимеров по размерам).
Для решения уникальных задач используются другие методы: гидрофильный, аффинный, хиральный. Выбор зависит от выполняемых задач и способа разделения.
Оборудование для ВЭЖХ
Автор фотографии:https://lifehack365.ru/xromatografiya/priboriy/
Современные хроматографы моноблочные, блочно-модульные, промежуточные (с модулями, установленными в блок). Основные параметры выбора — решаемые задачи и стоимость. Затраты минимальный при покупке моноблоков для решения конкретных специальных задач. Преимущества блочно-модульного оборудования заключается в возможности быстро менять состав системы.
Основные компоненты хроматографов:
-
блок подачи подвижной фазы (резервуар, фильтр, насос, инжектор);
-
блок разделения (система ввода образца, форматор, дегазатор, колонки);
-
блок детектирования.
В некоторых ситуациях требуется докомплектация системой автоматической чистки колонок, автосамплерами.
Виды детекторов для ВЭЖХ:
-
фотометрические (выбираются в 70% случаев, в том числе для фармацевтики);
-
рефрактометрические (универсальные, совместимые в любой подвижной фазой, но обладают сравнительно низкой чувствительностью);
-
флуориметрические (для работы с компонентами, обладающими флуоресценцией — ароматическими углеродами, отдельными видами витаминов без специальной подготовки проб);
-
диодно-матричные (для работы в видимом диапазоне УФ);
-
электрохимические (амперометрические, кондуктометрические на основе определения электрической проводимости исследуемых образцов).
Важный компонент системы — насос, всасывающий элюент, создающий контролируемый постоянный поток. Основное требование — способность создавать и поддерживать давление 50-400 атмосфер, контролировать скорость потока. В системах ВЭЖХ используются насосы с возвратно-поступательными движениями поршней, создающими минимум пульсаций. Рядом с насосом монтируется инжектор, вводящий в поток элюента образец исследуемого вещества.
Ключевой элемент хроматографа — колонки. В современных моделях ВЭЖХ они установлены в стальной корпус. Для наполнения используется силикагель, диоксид кремния, гели на основе полимеров. Ассортимент элюентов огромный, при выборе учитывается стабильность и уровень pH.
ВЭЖХ на данный момент считается наиболее эффективным методом хроматографии. При верном выборе модулей, фаз и условий появляется возможность проводить разнообразные исследования.
Преимущества, ограничения в использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии
Метод подходит для работы с нелетучими веществами, неустойчивыми при высоких температурах.
Достоинства ВЭЖХ:
-
молекулярная масса от нескольких до многомиллионных единиц;
-
при отсутствии воздуха процесс можно провести при комнатной или близкой к ней температуре;
-
высокая эффективность разделения;
-
максимальная селективность;
-
высокая скорость (всего несколько минут);
-
высокая чувствительность (возможность выделить микроскопические количества);
-
возможность провести на одной колонке несколько анализов при замене подвижной фазы;
-
можно работать с составами, которые растворяются в воде и растворителях.
Для исследования биополимеров и биологически активных соединений этот метод единственный возможный. Выделенные из смесей вещества можно исследовать при помощи других физических или химических методов.
Основные ограничения:
-
необходимость в специальном оборудовании (специальных колоннах и детекторах, насосах высокого давления);
-
необходимость во внедрении уникальных методов подготовки и чистки проб;
-
риск задержки отдельных соединений на неподвижной фазе;
-
невозможность использовать для работы с летучими соединениями;
-
сравнительно низкая пропускная способность при работе со сложными образцами.
При выборе решающее значение может иметь дороговизна внедрения и обслуживания, повышающая стоимость исследований. Существуют ситуации, при которых переплачивать нецелесообразно.
Область применения ВЭЖХ
Широкая область применения обусловлена универсальностью метода.
Этот тип хроматографов приобретают для:
-
определения состава полимеров, выявления примесей;
-
анализа веществ, загрязняющих воздух, воды, грунты;
-
определения количества медикаментов в тканях, моче, крови;
-
контроля качества в пищевой, фармацевтической промышленности;
-
выделения углеводов, нуклеиновых кислот, белков из биополимеров;
-
оценки качества продукции перед сертификацией.
В медицине широко используется разновидность ВЭЖХ — ультраэффективная жидкостная хроматография. Основное отличие от традиционной заключается в применении колонок с диаметром 1-4 мм и длиной 5-15 см, сорбентов 1,5-2 мкм. Такие системы позволяют повысить эффективность и сократить время проведения исследований. К минусам можно отнести необходимость в давлении 80-120 МПА. Важный плюс — возможность использовать для ВЭЖХ.
